CRISPR实验递送体系的选择

• Q1. CRISPR/Cas9 如何修饰真核基因组？

  针对目标序列设计的gRNA与Cas9结合，并将Cas9引导到目标序列，目标序列的PAM序列上游3-4个碱基处，Cas9切割产生双链断裂（DSB）。

  两种方法可以修复双链断裂：1. 如果不提供修复模板或供体DNA，则会通过易出错的非同源末端连接 (NHEJ) 进行重新链接，产生插入缺失从而敲除蛋白质。2. 如果提供修复模板或供体DNA，则会通过同源重组(HDR)方式修复双链断裂，以准确敲入目标基因。

  
• Q2. CRISPR实验如何选递送体系？

  易转染的细胞系可以选择质粒，转染效率低的细胞系建议选择病毒，期望达到编辑效率更高、毒性更低的效果可以选择RNP（即sgRNA+Cas9蛋白）的递送系统。

• Q3. 质粒递送体系中，all-in-one载体和双载体如何选择？

  All-in-one载体系统有两个主要优点：

  • 只需转染一次宿主细胞
  • 以1:1的比例进行gRNA和Cas9的导入

  双载体中，Cas9和gRNA在不同的载体上独立表达。如果您计划表达多个gRNA以进行多重靶向，双载体会更合适。对于这些应用，Cas9应首先在细胞系中稳定表达，然后可以用不同的gRNA载体转染细胞以构建细胞库。

• Q4. 什么时候需要慢病毒或腺相关病毒（AAV）载体？

  CRISPR 基因编辑的载体选择应考虑应用和细胞类型。

  • 在大多数易于转染的细胞系中，非病毒载体可以发挥很好的作用。
  • 慢病毒转染可以用在瞬时转染效率低的细胞中，例如原代细胞培养物或难以转染的细胞系。
  • AAV载体具有低免疫原性，是体内基因传递的较佳选择。由于AAV载体的载量限制通常小于其他载体（<5 kb），将SpCas9基因包装到这些载体中可能具有挑战性。金黄色葡萄球菌Cas9（SaCas9）比SpCas9小，是AAV载体的首选Cas9。
• Q5. 直接导入Cas9蛋白效果比用质粒DNA编码Cas9蛋白更好吗？

  直接使用Cas9蛋白或RNP的优势有：

  • 提高编辑效率：RNP中Cas9蛋白与sgRNA复合物结合率更高、更稳定；
  • 降低脱靶效应：质粒表达和消除可能受非预期因素干扰，而RNP中Cas9蛋白与sgRNA是非持续表达，结合后转导入宿主细胞，避免切割非靶序列；
  • 无DNA干扰：质粒本质是DNA，DNA可能随机插入宿主DNA的断裂处；
  • 无免疫原性：Cas9蛋白较之质粒，不易引起宿主细胞免疫反应，避免细胞因子等干扰；
  • 简便快捷：RNP转导后即可进行基因编辑，1天后可检测到编辑效率，自动降解。

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