CRISPR实验的技巧

• Q14. 转染或导入效率低怎么优化？

  一般来说主要通过以下方法：

  • 测试不同的转染试剂，如不同厂家的Lipo产品；
  • 测试不同的电转条件，如不同的电压或者电转buffer；
  • 测试不同的病毒感染条件，比如不同MOI，不同的Polybrene浓度。
• Q15. 设计有效的单链DNA模板有哪些技巧？

  对于点突变，建议使用非对称单链DNA设计。对于大片段基因插入，有报道显示插入基因侧翼长度可从300到1000bp。在大多数情况下，500bp长度的同源臂就可以了。需要注意的是设计需要包含沉默突变的ssDNA模板，使sgRNA PAM序列发生突变，以避免二次切割。KI供体设计可能很复杂。强烈建议使用软件（例如 snapgene）来查看和编辑序列。您可以阅读以下文章以获取更多设计技巧。

  Enhancing homology-directed genome editing by catalytically active and inactive CRISPR-Cas9 using asymmetric donor DNA. Nature Biotechnology.

• Q16. 提高CRISPR KI效率的小技巧
  1. sgRNA切割位点应靠近突变位点，一般情况，15bp 之内编辑效果较好。
  2. 在转染gRNA/Cas9和供体模板之前优化转染效率。
  3. 使用FACS筛选转染的细胞。
  4. 如果允许的话，使用药物或标记来选择 KI 克隆（例如，在插入基因的 C 端标记嘌呤霉素抗性基因以进行选择）。

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